Odabir aditiva za optimizaciju PCR-a radi otkrivanja SNP-ova u promotornom regionu EGFR gena kod NSCLC pacijenata

Abstract

U ovoj studiji smo ispitivali efekte aditiva koji se uobičajeno koriste za povećanje specifičnosti i prinosa PCR-a, konkretno za amplifikaciju EGFR SNP-ova -216G>T i -191C>A, kod NSCLC pacijenata. Aditivi se koriste u komercijalno dostupnim PCR kitovima, ali su često neophodna empirijska podešavanja, naročito u optimizaciji PCR-a za komplikovane DNK uzorke, kao što su regioni EGFR-a bogati GC parovima gde su smešteni SNP-ovi -216G>T i -191C>A. Svaki od testiranih aditiva je uključen u reakciju odvojeno i u različitoj koncentraciji npr. glicerol (5%, 10%, 15%, 20% i 25%), DMSO (5%, 7% i 10%), betain (0,5 M, 1,0 M, 1,5 M, 2,0 M i 2,5 M), formamid (1,25%, 2,5%, 5%, 7,5% i 10%), Tvin 20 (0,1%, 0,5%, 1% i 2%), Triton X-100 (0,1%, 0,5%, 1% i 2%), BSA (0,1 μg/μl, 0,5 μg/μl, 0,8 μg/μl i 1 μg/μl) i PEG (2,5%, 5%, 10%, 15% i 20%). Genotipizacija EGFR polimorfizama -216G>T i -191C>A je izvedena korišćenjem PCR-RFLP metode, a PCR i restrikcioni produkti su detektovani agaroznom ili poliakrilamidnom gel elektroforezom. Glicerol u koncentraciji od 15-20%, DMSO u koncentraciji od 7%-10% i betain u koncentraciji od 1–2 M su značajno povećali prinos i specifičnost PCR reakcije, dok su drugi aditivi bili neefikasni. Ovi rezultati pokazuju da je za svaki region od interesa potrebno posebno testirati odgovarajuće aditive i njihove koncentracije, jer iako su generalno preporučeni u literaturi, ne moraju da budu efikasni za svaki ispitivani region (gen) koji se dokazuje u određenoj PCR reakciji.